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微生物功能基因组学研究组

 

研究组长:赵国屏,研究员、中科院院士

主要研究方向及内容:
在多年从事工业微生物研究开发工作的基础上,课题组于上世纪末完成了从传统的生化生理向分子生物学的转变。本世纪以来,以基因组学研究为切入点,课题组又开始了从分子生物学向现代高度交叉的系统合成生物学研究的转变。目前,课题组的研究方向聚焦于下列两个方面:(1)在微生物基因组、功能基因组和比较基因组分析的基础上,系统研究放线菌(包括工业放线菌和疾病相关分枝杆菌)及模式细菌的代谢及其全局性调控网络。重点以氮代谢及其调控因子GlnR为主要研究对象,鉴定相关的转录因子及相应的顺式元件,鉴定对代谢途径中的关键酶及调控蛋白的翻译后修饰机制,最终建立定量的、系统的放线菌氮代谢调控模型。(2)合成生物学的使能技术的研究和开发。与实验室其他课题组合作,探索建立合成生物学元件拼接标准并在此基础上构建有应用价值的元件库;与国内其他课题组合作,开拓在人类及哺乳动物体系中的系统合成生物学研究与技术应用。课题组通过与相关基因组研究机构的合作,能够有效地利用基因组及各种生命组学技术平台。

研究队伍:
工作人员:邵志会(副研究员)、王敬之(实验师)
研究生:刘新强、徐君操、康潇蔓、王志慧、杨玉蛟、吴娜(上海科技大学)、周雅娟(上海科技大学)、吴嘉诚(上海科技大学)
联合培养生:李林显(河南大学)

年度研究进展:

(1)地中海拟无枝酸菌U32中GlnR调控利福霉素合成分子机制
作为放线菌中的一个全局性氮代谢调控因子,GlnR可以直接调控一系列初级代谢(如氮代谢)相关基因的表达;同时,它也参与了很多次级代谢的调控,例如,之前本实验室就已经发现,GlnR显著影响了地中海拟无枝酸菌U32的利福霉素产量,然而其分子机理并不清楚。在本研究中,我们通过real-time PCR、EMSA以及DNase I footprinting等一系列实验技术充分阐明了GlnR通过调控利福霉素合成基因簇(rif cluster)的转录来控制利福霉素合成的分子机制:GlnR既可以通过直接正调控rifK(编码AHBA合酶,是利福霉素生物合成途径中的一个关键结构基因)的转录来促进利福霉素前体AHBA的合成,又可以通过控制rifZ(近年来由我们鉴定完成的rif cluster的第一个途径特异性调控因子)的转录来间接地实现对整个rif cluster转录水平上的调控。这一结果不仅丰富了人们对GlnR介导的次级代谢调控的研究,还为今后改造工业菌株以提高利福霉素产量提供了重要的理论依据。


图1. U32中GlnR调控利福霉素合成的模型

(2)HOLMESv2:基于Cas12b trans切割活性和LAMP等温扩增技术的快速一步核酸检测方法
目前,基于CRISPR/Cas技术的核酸检测方法以其高特异性、灵敏度和实验设计简单的特点,在众多领域受到日益广泛的关注。此前已有报道,利用Cas12a切割靶标后被激活的trans切割活性和相关的扩增技术,开发了名为HOLMES和DETECTR的核酸检测方法。利用这些方法做测定时,核酸的扩增和检测步骤是分离的。这里,我们对隶属于Class 2 typeⅤ家族且具有trans切割活性的耐热型Cas12b进行了深入研究,测定了其发挥trans活性的反应温度、对单双链靶标的偏好性、对PAM的依赖性和检测核酸的浓度下限,并以原长或截短的sgRNA作引导,鉴定了其对SNP位点的敏感性。我们发现Cas12b在较宽的温度范围内均可发挥trans活性。之后,结合在同样温度条件下发挥作用的LAMP等温扩增技术,我们实现了在一个体系中同时进行扩增和检测的一步法恒温核酸检测,称之为HOLMESv2。另外,我们还利用能同时以DNA和RNA作模板的DNA聚合酶,完成了对RNA分子的一步法检测,大大简化了检测RNA样本的操作过程。


图2. HOLMESv2
Figure 2. HOLMESv2. (a) Cas12b has trans cleavage activity on collateral ssDNA when sgRNA and its target DNA (dsDNA or ssDNA) exist; (b) Schematic of nucleic acid detection by HOLMESv2 with both LAMP (or RT-LAMP) and Cas12b detection; (c) Quantitation of target DNA by one-step HOLMESv2. Serially diluted plasmid pUC18-rs5082 was used as the targets, and FAM-N12-20 Eclipse was used as the probe detected by a real-time machine; (d) Standard curve analysis of the one-step HOLMESv2. Fluorescence values were collected for targets ranging from 1 nM to 10-5nM at the time point of 120 min.

年度代表性论文:

  1. Qi F#, Lei C#, Li F, Zhang X, Wang J, Zhang W, Fan Z, Li W, Tang GL, Xiao Y*, Zhao G, Li S* (2018) Deciphering the late steps of rifamycin biosynthesis. Nat Commun. 9(1):2342.
  2. Li Z, Liu X, Wang J, Wang Y, Zheng G, Lu Y, Zhao G, Wang J* (2018) Insight into the Molecular Mechanism of the Transcriptional Regulation of amtB Operon in Streptomyces coelicolor. Front Microbiol. 9:264.
  3. Lei X, Wang L, Zhao G*, Ding X* (2018) Site-specificity of serine integrase demonstrated by the attB sequence preference of ?BT1 integrase. FEBS Lett. 592(8):1389-1399.
  4. Yu Y, Tang B, Dai R, Zhang B, Chen L, Yang H, Zhao G*, Ding X* (2018) Identification of the streptothricin and tunicamycin biosynthetic gene clusters by genome mining in Streptomyces sp. strain fd1-xmd. Appl Microbiol Biotechnol. 102(6):2621-2633.
  5. Zhang Y, Zhang Y, Li P, Wang Y, Wang J, Shao Z*, Zhao G* (2018) GlnR positive transcriptional regulation of the phosphate-specific transport system pstSCAB in Amycolatopsis mediterranei U32. Acta Biochim Biophys Sin. 50(8):757-765.
  6. Lei C, Wang J, Liu Y, Liu X, Zhao G, Wang J* (2018) A feedback regulatory model for RifQ-mediated repression of rifamycin export in Amycolatopsis mediterranei. Microb Cell Fact. 17(1):14.
  7. Li SY#, Cheng QX#, Wang JM, Li XY, Zhang ZL, Gao S, Cao RB, Zhao GP, Wang J* (2018) CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov. 4:20.
  8. Li SY, Cheng QX, Liu JK, Nie XQ, Zhao GP, Wang J* (2018) CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Res. 28(4):491-493.
  9. Fan XY, Tang BK, Xu YY, Han AX, Shi KX, Wu YK, Ye Y, Wei ML, Niu C, Wong KW, Zhao GP*, Lyu LD* (2018) Oxidation of dCTP contributes to antibiotic lethality in stationary-phase mycobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 115(9):2210-2215.
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