澳门金莎娱乐手机版-集团app网站官网

微生物代谢调控与代谢工程研究组

研究组长:姜卫红,研究员

主要研究方向及内容:
课题组致力于开展重要工业微生物的代谢调控和代谢工程研究,聚焦产溶剂梭菌和产抗生素链霉菌。在建立和完善分子遗传操作平台的基础上,发掘和鉴定与重要表型相关的功能基因、代谢途径和调控因子,解析其分子机制;并进行重要功能元件(结构元件、调控元件和信号响应元件)的作用适配和功能优化,从而为相关工业菌株高效合成化学品或天然产物提供分子改造的元件和策略。

研究队伍:
工作人员:顾阳,黄鹤,柴常升,郑国松
博士后:杨云鹏,李雷
博士研究生:杨高华,张露,田进忠,张灿,刘彦强,贾德臣,张焕
工程硕士(导师为顾阳):赵斌,张小艳,徐蓉
联合培养硕士研究生(河南大学):赵然,刘小草

年度研究进展:

1. 产溶剂梭菌的代谢调控与基因编辑技术研究

(1)揭示丙酮丁醇梭菌全局转录因子CcpA的新型双向自调控机制
革兰氏阳性菌中全局转录因子CcpA(catabolite control protein A)控制着多种代谢途径及其调控网络,在细胞的生理和代谢调节中发挥着重要作用。尽管已知CcpA主要是通过与顺式作用元件cre结合而影响下游靶基因的表达,但作为如此重要的全局转录因子,其自身的表达是否受到调节以及如何被调节这一问题未得到充分解答。我们以重要的产溶剂梭菌—丙酮丁醇梭菌为研究对象,揭示了一种基于双cre位点的CcpA新型自调控机制。在该调控模型中,ccpA基因的启动子和编码区被发现各存在一个被自身编码的CcpA蛋白识别的cre位点,我们分别命名其为creP和creORF。其中,creP的序列具有特殊性,是一种非典型的、不同于已报道cre基序的新型CcpA结合位点。进一步的研究结果显示,creP对ccpA的表达发挥正调控作用,而与之对应的creORF则负调控ccpA的表达。因此,creP和creORF的协同作用实现了CcpA对自身表达的双向自调控。此外,相对于creP的正调控作用,creORF在整个发酵期间对CcpA表达的负调控作用更为明显。在上述研究的基础上,我们对creORF位点进行了同义突变,解除CcpA对自身的负调控作用,这一策略实现了胞内CcpA表达量的提高,进而在总体上改善了细胞性能,提升了菌株的溶剂发酵产量。该研究不仅揭示了革兰氏阳性菌中CcpA蛋白的一种新型自调控机制,解答了上述“CcpA蛋白表达是否受到自身调节以及如何被调节”这一问题,同时为该工业菌株的遗传改造提供了新的可行策略。相关研究工作发表在Applied and Environmental Microbiology上。


图1. 梭菌CcpA的新型双向自调控机制

(2)基于噬菌体丝氨酸整合酶的位点特异性重组技术的建立及其在异源基因簇表达中的应用
食气梭菌的重要价值在于能够利用CO和CO2等一碳气体发酵,因此可被进一步改造用于合成各种高值化学品和生物燃料,是构建一碳气体细胞工厂的优选对象。实现上述目标的关键技术之一是能够在食气梭菌染色体上高效地整合各种异源生物合成途径,从而快速获得新的目标产物,然而,这一遗传操作过程目前仍受限于相关分子工具的匮乏。鉴于此,我们以主要的食气梭菌—永达尔梭菌(Clostridium ljungdahlii)为研究对象,首次建立了该菌的噬菌体丝氨酸整合酶介导的位点特异性重组技术,解决了上述技术难题。我们将两种异源的噬菌体整合系统(来自艰难梭菌和链霉菌)引入永达尔梭菌中,并验证了它们催化重组的活性。利用该系统实现了外源大片段DNA在永达尔梭菌染色体上的高效整合。在此基础上,借助于CRISPR-Cas9基因编辑系统以及两套噬菌体整合系统的协同作用,进一步实现了特定DNA片段在永达尔梭菌染色体上的“无痕”整合(不引入任何筛选标记)。作为验证,我们利用上述技术将来自于丙酮丁醇梭菌的丁酸合成途径(8500 bp)整合至永达尔梭菌基因组中,所得工程菌株可发酵CO2/CO混合气体有效合成丁酸。更重要的是,工程菌株在连续传代培养中表现出良好的遗传稳定性和丁酸合成能力。本研究成果填补了目前食气梭菌分子遗传改造技术的一个空白,并有望扩展到其他类型的梭菌中(Metab Eng, revised)。


图2. 食气梭菌位点特异性重组技术

2. 产抗生素链霉菌基因组编辑与基因转录技术的研发与应用

(1)基于CRISPR/dCas9的多基因转录抑制技术的建立及应用
链霉菌是一种重要的工业微生物,具有强大的次级代谢能力,能够产生众多活性天然产物,是新药挖掘的重要来源。但与其他模式菌(如大肠杆菌和酿酒酵母)相比,此类细菌的遗传操作要困难得多。最近,基于CRISPR/Cas9或dCas9的基因编辑技术已相继建立,显著提升了链霉菌的基因组编辑效率。但至今,CRISPR/dCas9介导的基因转录抑制技术(CRISPRi)仅设计用于抑制单一基因的转录,通量较低。为此,我们在模式菌—天蓝色链霉菌中开发了一种新型的CRISPRi系统,可用于多基因的转录抑制。该系统以整合型载体pSET152为骨架进行dCas9/gRNA的表达,2个元件(dCas9与gRNA)均由组成型启动子驱动。运用这种整合型CRISPRi技术,我们分别实现了2、3、4个基因的高效同步转录抑制;以4个基因的同步抑制为例,与对照(仅含dCas9质粒)组相比,含有四基因靶向gRNA的CRISPRi系统可以将靶基因的转录水平下调至2-32%。另外,该系统被成功用于链霉菌功能基因的快速筛选,鉴定了一个与天蓝色链霉菌生长密切相关的ANTAR类RNA结合蛋白编码基因(编号为SCO2013)。总之,该CRISPRi可以用于链霉菌多基因的高效同步转录抑制,必将大大加速链霉菌功能基因的鉴定以及代谢工程研究。相关研究成果已发表在Biotechnology Journal上。


图3. CRISPR/dCas9介导的多基因转录抑制技术示意图

(2)CRISPR/Cpf1介导的高效基因组编辑及基因转录抑制技术的建立
至今,在链霉菌中已建立了基于CRISPR/Cas9(来源于酿脓链球菌,SpCas9)的高效基因组编辑技术,大大提高了链霉菌的遗传操作效率。但该系统尚存在一些问题,主要包括:1)SpCas9的导入对有些重要链霉菌的生长存在很大毒性;2)当靶向多个靶基因时,编辑载体的构建比较复杂,耗时耗力。为了弥补这些不足,我们发展了基于CRISPR/Cpf1(来源于新凶手弗朗西丝氏菌,FnCpf1)的高效多重基因组编辑及转录抑制技术。在同源臂存在情况下,CRISPR/Cpf1系统可以在天蓝色链霉菌中进行单基因或双基因的高效率缺失(75-95%);引入了外源非同源末端链接(NHEJ)系统,在没有同源臂存在的情况下实现了DNA的缺失,简化了载体构建流程;另外,还建立了基于CRISPR/ddCpf1(DNase I切割活性丧失的Cpf1)的多基因转录抑制技术,实现3个基因的高效同步抑制;最后,研究显示FnCpf1与SpCas9具有不同的链霉菌适用性,证明FnCpf1可以在无法使用SpCas9进行基因组编辑的5-酮-米尔贝霉素产生菌-吸水链霉菌SIPI-KF中实现高效的基因缺失。综上所述,FnCpf1是链霉菌现有CRISPR基因组编辑工具箱比不可少的补充,必将进一步推动链霉菌的遗传改造及功能基因组学研究。该技术已与多家单位分享,相关研究结果发表于Applied and Environmental Microbiology上。


图4. 基于CRISPR/Cpf1的多基因编辑与转录抑制技术

年度代表性论文:

  1. Zhang L, Liu YQ, Yang YP, Jiang WH*, Gu Y* (2018). A novel dual-cre motif enables two-way autoregulation of CcpA in Clostridium acetobutylicum. Appl Environ Microbiol, 84(8), pii: e00114-18.
  2. Yang YP, Nie XQ, Jiang YQ, Yang C*, Gu Y*, Jiang WH* (2018). Metabolic regulation in solventogenic clostridia: regulators, mechanisms and engineering. Biotechnol Adv, 36: 905-914.
  3. Li L, Wei KK, Zheng GS, Liu XC, Chen SX, Jiang WH*, Lu YH* (2018). CRISPR-Cpf1-assisted multiplex genome editing and transcriptional repression in Streptomyces. Appl Environ Microbiol, 84(18), pii: e00827-18.
  4. Zhao YW, Li L, Zheng GS, Jiang WH, Wang ZJ*, Lu YH* (2018). CRISPR/dCas9-mediated multiplex gene repression in Streptomyces. Biotechnol J, 13(9):e1800121.
  5. Li L, Jiang WH*, Lu YH* (2018). A modified Gibson assembly method for cloning large DNA fragments with high GC Contents. Methods Mol Biol, 1671:203-209.
XML 地图 | Sitemap 地图