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真菌分子遗传与合成生物学研究组

研究组长:周志华,研究员

主要研究方向及内容:
在多年从事微生物元基因组及微生物资源研究开发工作的基础上,课题组近年来完成了从微生物分子生态与微生物资源向分子生物学与合成生物学的转变。目前,课题组的研究方向聚焦于生物元件的挖掘与鉴定、真菌底盘细胞的分子生物学及基因组编辑的研究。具体而言,真菌被广泛应用于医药、食品、能源和轻工等诸多领域。里氏木霉具有强大的蛋白合成与分泌能力,酿酒酵母为天然产物生物合成的优良底盘细胞。本课题组近期的研究目标为:基于碳水化合物活性酶(糖基水解酶、糖裂解酶、糖酯酶和糖基转移酶等)的基因资源挖掘与功能鉴定,构建木质纤维素降解酶/酶系和重要萜类化合物合成的真菌细胞工厂。主要研究方向包括:(1)生物元件(主要为碳水化合物活性酶)的规模化挖掘、功能鉴定与改造;(2)里氏木霉中纤维素酶合成与分泌调控机制的研究及其遗传改造;(3)高效降解木质纤维素的酶系设计与重构;(4)重要萜类化合物的酵母细胞工厂的设计、构建与适配性优化。课题组目前参与一项新药创制重大专项及承担两项自然科学基金面上项目、一项自然基金应急项目。

研究队伍:
工作人员:严兴(研究员)、邹根(副研究员)、王燕(副研究员)、沈潇(实验师)
博士后:Tamilvendan、王平平、于璐
研究生:杨成帅、柴顺星、李晓东、朱志华、李超静、肖美丽、Waqas
联合培养生:邢宏观(华东理工大学)、田尔诺(华东理工大学)、樊震鋆(河南大学)、王加莉(河南大学)

年度研究进展:

(1)利用酿酒酵母细胞工厂高效合成稀有人参皂苷Rh2
合成生物学技术的应用已实现利用微生物发酵从头合成多种稀有活性天然产物,然而,为了达到理想的合成效率,有必要对微生物细胞工厂进行系统改造包括对前体途径的改造以及关键合成元件的优化等。人参皂苷Rh2是一种具有抗癌等多种活性的稀有人参皂苷。在前期工作中(Wang et al. Metab. Eng. 2015)我们完成了稀有人参皂苷Rh2合成途径关键UGTPg45元件的功能鉴定,首次完整解析了稀有人参皂苷Rh2的合成途径。在此基础上,我们构建了利用单糖发酵从头合成Rh2的第一代酿酒酵母细胞工厂。然而,由于PPD前体合成效率低以及UGT元件与底盘适配性不足等问题,导致Rh2合成效率很低(16.9 mg/L)。为进一步提高Rh2合成效率,针对第一代细胞工厂存在的问题,我们首先重新设计与构建了第二代PPD底盘细胞,通过系统强化MVA途径以及优化细胞色素P450的表达使PPD产量提高7.5倍以上,达到529.0 mg/L,通过发酵优化PPD产量达到11.0 g/L。基于这一新的底盘,我们又对PPD向Rh2转化的一步糖基化反应进行了系统优化,其中包括(1)通过启动子优化和拷贝数调节提高UGT在底盘中的表达效率;(2)从元件库中筛选其它物种中可以用于合成Rh2的优质UGT元件;(3)通过定向进化提高UGT元件与底盘细胞之间的适配性等。最终通过对这些策略的有效结合,我们使Rh2产量提高近了10倍,达到179.3 mg/L,在10-L 发酵罐中产量达到2.2 g/L。该产量不仅是目前已报道的通过微生物发酵合成Rh2最高产量,而且相比现有的基于植物提取和微生物转化的Rh2制备工艺也具有了初步的成本优势,并为酵母细胞工厂生产稀有天然产物, 特别是糖基化的天然产物提供了一个成功的范例,相关工作已撰写论文,并已被Cell discovery杂志接收。


图1. 设计与构建第二代酿酒酵母细胞工厂高效合成稀有人参皂苷Rh2
Figure1. Design and construction of a second-generation Saccharomyces cerevisiae cell factory to efficiently synthesize rare ginsenoside Rh2

(2)灵芝酸生物合成途径细胞色素P450的挖掘和鉴定
灵芝酸是一类结构多样的羊毛甾烷型三萜化合物,是著名药用真菌灵芝的主要活性成分,具有抗菌、抗病毒、抗癌和降血糖等药理活性。目前已有150多种灵芝酸被分离和鉴定。虽然灵芝的转录组和基因组的测序工作已相继完成,但是由于灵芝生长周期长并且遗传操作技术不成熟,导致灵芝酸的生物合成途径尚未得到解析。目前灵芝酸的生物合成被普遍认为是由甲羟戊酸途径合成羊毛甾醇,通过对羊毛甾醇骨架进行一系列的羟基化,氧化还原和乙酰化修饰进而形成各种各样的灵芝酸。其中细胞色素P450被认为广泛参与了灵芝酸的生物合成途径。我们课题组与肖友利研究员课题组合作通过灵芝转录组数据分析以及建立标准化的细胞色素P450表征方法,解析了灵芝酸合成途径中一个重要的P450元件(CYP512U6)。CYP512U6可以特异性地催化灵芝酸DM和TR的C-23位羟基化修饰,相应分别生成hainanic acid A和灵芝酸Jc(图2)。此外,我们还发现酿酒酵母自身C-3酮甾醇还原酶ERG27可以将灵芝酸DM的C-3位的酮基还原成羟基生成灵芝酸7-oxo-ganoderic acid Z,而CYP512U6可以进一步羟基化灵芝酸7-oxo-ganoderic acid Z的C-23位生成一个新的化合物灵芝酸3β,23S-dihydroxy-7-oxo-5α-lanosta-8,24(E)-dien-26-oic acid(命名为灵芝酸ZXYL)。另外,我们还对灵芝自身的细胞色素P450还原酶(GLCPR)进行了克隆和功能鉴定,结果显示灵芝细胞色素P450还原酶(GLCPR)可以有效得协同灵芝P450元件完成体外的催化反应。上述工作为解析灵芝酸合成途径中的其它P450元件提供了技术平台,将有助于促进灵芝酸生物合成途径的全面解析。相关工作已经在Phytochemistry杂志上发表。


图2. 灵芝细胞色素P450 CYP512U6参与灵芝酸生物合成。
Figure2. G. lucidum cytochrome P450 CYP512U6 is involved in ganoderma acid biosynthesis

(3)β-葡萄糖苷酶BGL3I参与里氏木霉纤维素酶诱导调控的机制研究
乳糖或纤维素等诱导剂能够诱导丝状真菌里氏木霉大量表达分泌纤维素酶,但是相关纤维素酶诱导的机制尚未完全解析。通过分析转录激活因子Xyr1敲除菌株的转录组数据,我们发现β-葡萄糖苷酶BGL3I的表达水平与其他β-葡萄糖苷酶表达水平明显不一致,并且在敲除bgl3i后,虽然对里氏木霉菌株生长无显著影响,但敲除菌株的纤维素酶表达量显著上升,这说明BGL3I很可能参与了里氏木霉中纤维素酶诱导的复杂调节系统。进一步分析表明, bgl3i的缺失还导致里氏木霉细胞外半乳糖苷酶活性降低,而乳糖通透酶的转录则显著增加,这表明bgl3i的表达会影响诱导剂乳糖的转运。此外,bgl3i的缺失还同时增强了里氏木霉胞内β-葡糖苷酶cel1a、cel1b和转录调节因子xyr1的转录水平,这些基因在里氏木霉中乳糖诱导过程中都必须高表达。此外,我们还发现BGL3I具有相对较高的水解槐糖的能力,而槐糖被认为是里氏木霉中纤维素酶合成的最强天然诱导物。上述工作表明 BGL3I参与了里氏木霉复杂的纤维素酶诱导调控系统,并初步解析了BGL3I参与调控纤维素酶分泌的作用机制(图3),从而为提高里氏木霉菌株纤维素酶产量的提供了新策略。相关工作已撰写论文,并已被Biotechnology for Biofuels杂志接收。


图3. Bgl3I在乳糖诱导纤维素酶合成途径中的作用
Figure3 Model of a possible lactose induction process for initiating efficient cellulase formation

年度代表性论文:

  1. Gen Zou, Yanping Jiang, Rui Liu, Zhihua Zhu, Zhihua Zhou. The putative β-glucosidase BGL3I regulates cellulase induction in Trichoderma reesei. Biotechnology for Biofuels. 2018. 11:314.
  2. Pingping Wang, Wei Wei, Wei Ye, Xiaodong Li, Wenfang Zhao, Chengshuai Yang, Chaojing Li, Xing Yan, Zhihua Zhou. Synthesizing ginsenoside Rh2 in Saccharomyces cerevisiae cell factory at high-efficiency. Cell Discovery. 2018. (accept)
  3. Chengshuai Yang#, Weichao Li#, Chen Li#, Zhihua Zhou*, Youli Xiao*, Xing Yan*. Metabolism of ganoderic acids by a Ganodermalucidum cytochrome P450 and the 3-keto sterol reductase ERG27 from yeast. Phytochemistry, 2018, 155:83-92.
  4. Yongjun Wei, Lei Zhang, Zhihua Zhou, Xing Yan. Diversity of Gene Clusters for Polyketide and Nonribosomal Peptide Biosynthesis Revealed by Metagenomic Analysis of the Yellow Sea Sediment. Frontiers in Microbiology, 2018, 9:295.
  5. Chunyan Liu, Gen Zou, Xing Yan*, Xuguo Zhou*. Screening of multimeric β-xylosidases from the gut microbiome of a higher termite, Globitermes brachycerastes. International Journal of Biological Sciences, 2018. 14(6):608-615.
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