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天然产物合成生物学研究组

研究组长:王勇,研究员,重点实验室副主任

主要研究方向及内容:
本课题组主要从事天然产物的合成生物学研究。研究内容涉及各种与天然产物合成相关的基因、模块、途径和宿主等资源的分离、鉴定;天然产物的合成生物学设计与异源合成等。基于合成生物学人工设计的原理,获得可用于药物研发的天然的或非天然的复杂次生代谢产物;改进复杂天然产物的生物合成效率和其生产方式,是我们研究的核心内容。具体内容包括:(1)天然产物生物合成元件的筛选;(2)天然产物生物合成宿主的设计与改造;(3)代谢途径工程、生物过程工程及生物反应器工程研究。

研究队伍:
工作人员:刘海利(副研究员)、李建华(助理研究员)、吕华军(助理研究员)
博士后:孙雨伟、Ishmael Mutanda
研究生:刘志凤、邵洁、陈卓、田晨菲、张前、许建林、张英
联合培养生:许方琳(河南大学)

年度研究进展:

(1)甜菊糖苷类二萜化合物的糖基转移酶的多样性与专一性机制解析
甜叶菊(Stevia rebaudiana)、甜叶悬钩子(Rubus suavissimus)和明日叶(Angelica keiskei)是三种含二萜糖苷类甜味成分的药食两用植物。这类甜味成分以四环二萜steviol为母核,在C13和C19位进行多样的糖基化修饰形成。甜茶素(rubusoside)是其中一种稀有的糖基化贝壳杉烯型四环二萜,其甜度约为蔗糖的300倍而热量仅仅为蔗糖的1/10,是一种理想的天然甜味剂。新近的报道表明,甜茶素是首个发现的可同时抑制人果糖转运蛋白GLUT5和葡萄糖转运蛋白GLUT1的小分子化合物,具有独特的药理活性。
为了解析甜茶素的合成途径,本课题组在前期甜菊糖苷的工作基础上,进一步对甜叶悬钩子和明日叶的叶组织样本进行了转录组分析,通过物种间基因进化分析、结合基因克隆表达与功能表征,找出了甜茶素生物合成过程中的糖基化途径的关键酶基因,发现甜叶悬钩子来源的RsUGT75L20、RsUGT75T4、RsUGT85A57和明日叶来源的AkUGT75L21、AkUGT75W2、AkUGT85A58参与了这一过程。在对甜叶悬钩子来源的RsUGT85A57的深入研究中进一步发现,RsUGT85A57具有高度的底物专一性,仅催化19位具有糖基的steviol衍生物。为了研究糖基转移酶如何专一性地识别底物,我们通过同源建模分析,对RsUGT85A57中可能影响二萜底物识别的20个N端和5个C端氨基酸残基进行了定点突变,发现L141M、S149G和L153F三个位点的突变使得RsUGT85A57的底物专一性降低,表明它们在二萜底物的专一性识别方面起到重要作用。最终,我们通过不同物种来源的糖基转移酶的正交组合,在微生物细胞中实现了甜茶素的高效全细胞转化。相关工作已经发表在Molecular Plant上。此外,本研究成果已与浙江震元制药有限公司签署了基于合成生物技术的甜茶素产业化开发协议。


图1. 甜叶悬钩子、明日叶中甜茶素的糖基化修饰途径

(2)大肠杆菌从头合成黄芩素和野黄芩素
黄芩素(Baicalein)是一种黄酮类化合物,为唇形科多年生草本植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)干燥根中的主要活性成分之一。研究证明,黄芩素具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡以及改善学习记忆能力等广泛的生物学活性。而野黄芩素则主要存在于菊科植物灯盏花(Erigeron karvinskianus)中,具有消炎止痛、活血化瘀和祛风除湿等功效。它们均具有好的药物开发前景。这两个黄酮化合物的主要区别在于黄酮母核B环4’位是否有羟基取代。鉴于它们结构的相似性,我们希望构建一种大肠杆菌能够在选择性地以苯丙氨酸或酪氨酸为添加底物,定向合成黄芩素或野黄芩素。
本研究将7个不同物种来源的基因11个基因装配到3个质粒上并转化大肠杆菌BL21(DE3),最终实现了黄芩素/野黄芩素的合成。首先将不同植物来源的黄酮类合成基因4CL、PAL、CHS、CHI,构建合成二氢黄酮柚皮素/松属素模块。进一步通过酶活性筛选在上述模块中引入FNS I从而构建了黄酮白杨素/芹菜素的合成模块。为了合成黄芩素和野黄芩素,我们通过克隆黄芩来源的F6H及拟南芥的AtCPR并通过N端引入不同的助溶标签来实现该步羟基化反应效率最高的组合。另外,针对丙二酰辅酶A的供应,本文对丙二酰辅酶A的来源进行了代谢工程改造,丙二酰辅酶A合成基因acs和脂肪酸合成基因fabF一起过表达,并引入丙二酰外源添加突进MatB-MatC,从而实现了在摇瓶中黄芩素23.6毫克/升和野黄芩素106.5 毫克/升。本研究的策略和发现可以为其他黄酮类化合物异源合成提供借鉴。


图2. 黄芩素和野黄芩素在大肠杆菌中的合成

(3)从海洋链霉菌中发现新型酰基取代氨基寡糖类降糖活性候选药物
糖尿病已成为严重危害人类健康的公共卫生问题。多脏器并发症是糖尿病引起死亡及残疾的主要原因,大量研究表明,波动性高血糖比持续性高血糖更能促进糖尿病慢性血管并发症的发生与发展。以α-糖苷酶为靶标的抑制剂类药物能有效控制餐后血糖波动,是目前糖尿病治疗中的一线药物。目前应用于临床的α-糖苷酶抑制剂类药物有三个,包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等,但其制备工艺复杂,生产成本高,有肠胀气等不良反应。因此,设计和筛选新型的α-糖苷酶抑制剂是目前抗糖尿病药物的开发热点之一。
我们从我国日照采集到黄海海泥样品中,获得一组富含氨基糖苷类化合物的菌株。针对其中的HO1518菌株,结合氨基糖苷类化合物的质谱裂解规律,对其进行追踪,最终发现并获得一系列结构新颖酰基取代的氨基寡糖类化合物。经体外生物活性筛选发现,这组酰基取代的氨基寡糖类化合物均较临床上使用的降糖药物—阿卡波糖具有更强、更为理想的?-糖苷酶抑制活性。其中,D6-O-acetyl-acarviostatin II03 (1)和D6-O-β-hydroxybutyryl-acarviostatin II03 (2),其IC50值仅为0.029和0.049 μM,较阿卡波糖(15.7 μM)强约540和320倍; D6-O-acetyl-acarviostatin I03 (3),D6-O-propionyl-acarviostatin I03 (4)和 D6-O-β-hydroxybutyryl-acarviostatin I03 (5),其IC50值分别为0.693,0.625和0.495 μM,较阿卡波糖强约23-80倍。上述系列酰基取代的氨基寡糖类化合物,有望开发成为新型的降糖活性候选药物,值得深入研究与开发。上述研究工作发表在Mar. Drugs 2018, 16, 403; doi:10.3390/md16110403上,并申请1项专利(申请号:201811224799.7)。


图3. 酰基阿卡他定1-5的化学结构

年度代表性论文:

  1. Yuwei Sun, Zhuo Chen, Jianxu Li, Jianhua Li, Huajun Lv, Jingya Yang, Weiwei Li, Dingan Xie, Zhiqiang Xiong, Peng Zhang, Yong Wang*. (2018) Diterpenoid UDP-glycosyltransferases from Chinese Sweet Tea and Ashitaba Complete the Biosynthesis of Rubusoside. Molecular Plant, 10, 1308-1311. http://doi:10.1016/j.molp.2018.05.010
  2. Haili Liu, Hengchao E, Dingan Xie, Wenbo Cheng, Wanqi Tao, Yong Wang*. (2018) Acylated Aminooligosaccharides with Inhibitory Effects against α-Amylase from Streptomyces sp. HO1518. Mar Drugs, 16, 403. https://doi.org/10.3390/md16110403
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