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微生物催化与微生物活性产物工程研究组

研究组长:李平作,研究员

主要研究方向及内容:
课题组以微生物学技术、基因工程、酶工程及发酵工程技术为依托,注重与合成生物学技术的集成应用,开展微生物催化、真菌类活性产物筛选与发现、代谢途径分析;工程菌构建、改造与差异表达等方面的研究与开发。课题组也与其他单位课题组合作开展SNP和DNA甲基化分析研究。

研究队伍:
工作人员:王莉、叶晴

年度研究进展:

(1)HMGR-GDH辅因子再生系统对赤芝三萜类化合物合成的影响
将外源NADPH再生系统,HMGR-GDH转入Clitopilus prunulus,强化了代谢途径上大多数酶的表达,尤其是HMGR的表达水平增加了30%以上,二萜化合物截短侧耳素(Pleuromutilines)产量提高了17%。为验证NADPH再生系统对赤芝三萜化合物(Ganoderic acids)合成的影响,我们将该系统导入赤芝(Ganoderma lucidum)构建了GL-HMGR-GDH 工程菌株。由于Ganoderic acids的生物合成途径未见完整报道,参考已有的萜类合成途径,认为主要是通过MVA途径合成,因此推测其关键酶主要由3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA合酶(HMG),3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶(HMGR),甲羟戊酸激酶 (Mk),二萜烯环化酶 (DC),单萜环化酶 (MC),倍半烯环化酶 (SC),角沙烯合酶 (SS),异戊烯转移酶 (PF),牤牛儿基焦磷酸合酶 (GGPP),法呢基焦磷酸合酶 (FDS),并在mRNA水平上测试了外源HMGR-GDH系统对关键酶表达的影响,结果表明HMGR表达水平增加20%以上,Ganoderic acids产量提高15.7%(见图1和表1)。

(2)Clitopilus prunulus转录组序列及关键酶分析
转录组进行了测序初步结果如下表,结果表明:转录基因组大约6G,基因数2万多个,与萜类代谢直接相关的酶有52个,代谢途径有10条。见图2
通过数据库比对,获得3个关键酶HMGR、GGPP和SC,为进行功能验证奠定了基础。


图2. Clitopilus prunulus的转录组测序信息

(3)工程菌C. prunulus-HmgrGdh发酵工艺放大优化。
在前期300升发酵罐优化实验基础上,以提高Pleuromutilines产量为目标,通过对C. prunulus-HmgrGdh的发酵过程进行放大优化,提高在工业生产规模上的产量水平。优化基于营养与非营养性因子的生物反应系统,优化了碳源、氮源、通风量、流加诱导剂策略等因子,结果表明,以5.5%葡萄糖为碳源,以0.5%豆粕粉为氮源,在1:1通风量和pH控制5.5的条件下,采用分批流加发酵,在Pleuromutilines形成期流加0.5g/L/h豆油,在3000升发酵罐的规模上,Pleuromutilines产量达到37mg/ml,较原来的31mg/ml提高了19%以上。

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